ABI 7500熒光定量PCR儀技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，zui后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

　　

　　1.Ct值的定義

　　

　　在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個很重要的概念--Ct值。C代表Cycle，t代表threshold（閾值，臨界值），Ct值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

　　

　　2.熒光閾值的設(shè)定

　　

　　PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold=10′SDcycle3-15

　　

　　3.Ct值與起始模板的關(guān)系

　　

　　研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
 

 

　　

　　ABI 7500熒光定量PCR儀是特異性靶基因檢測與定量的一體化平臺。7500將PCR熱循環(huán)，熒光檢測和各種應(yīng)用分析軟件結(jié)合在一起，可以動態(tài)觀察PCR每一循環(huán)各反應(yīng)管中PCR擴增產(chǎn)物逐漸增加的情況。

　　

　　定量PCR系統(tǒng)的標準模式采用25-100微升反應(yīng)體積，可以采用96孔板或單管/8聯(lián)管進行實驗反應(yīng)。另外7500還可以升級為快速熱循環(huán)樣品基座，該升級為選購件，由AB公司工程師負責(zé)安裝?？焖贌嵫h(huán)樣品基座采用新型96孔反應(yīng)板，這種反應(yīng)板的管內(nèi)液體上方的空間較小，可以支持5-30微升反應(yīng)體積的實驗。采用樣品基座升級后的7500，新型96孔反應(yīng)板和新型快速熱循環(huán)定量PCR預(yù)混試劑，實時定量PCR實驗可以在40分鐘內(nèi)完成，實驗效果與標準2小時模式一致。

　　

　　ABI 7500熒光定量PCR儀應(yīng)用廣泛，包括基于相對定量分析的基因表達分析，以標準曲線為基礎(chǔ)的病原體定量分析，定性的PCR擴增后核酸序列的SNP基因型分析，以及以陽性內(nèi)對照為基礎(chǔ)的陽性/陰性結(jié)果判定。